徠卡顯微鏡:共聚焦顯微鏡的來源白光激光束

2020-05-27 13:36:37 107

共聚焦顯微鏡在生物醫學應用的理想光源應如何執行?它應具有足夠的強度,可調諧的顏色同時激發的一系列樣品。此外,它應該是一個脈沖光源壽命熒光實驗。已經發明這種源:白光激光器。它由一個高能量脈沖IR被饋送通過光子晶體光纖的光纖激光器,產生的光譜的連續。小bandlets選自該連續的聲光可調諧濾波器的裝置。該儀器提供足夠激烈,像一個普通的激光束 這是衍射極限照明的要求,可調焦的光。它允許通過頻譜從藍色到紅色的顏色的連續調諧。八并行可調顏色為標準。,它提供了一些額外的好處,這是由于由脈沖的能量發射。它本質上是一種基于單光子熒光壽命成像源。并且它允許抑制在檢測信道的激發光通過玻璃 自由電子發射濾波。


Fig_0_Lambda_square_01



*連續譜白光光源


古典激光光源通常只提供一個單一的窄的發射。某些氣體激光器可以同時發射了幾行。最**的例子是氬氣體激光器,這可能是有5條線中的藍綠色的范圍內。其他類型的激光器,染料激光器一樣,是可調諧的,但一次只發射單一的顏色。此外,染料激光器是非常不穩定的,需要一定的耐心才能正常運行。有全固態激光器是可調諧的,但僅限于紅外范圍(如鈦薩激光器)。除了其高復雜性和昂貴,他們也可以只發出單一波長的時間和調整過程是很慢的(多少秒)。


這種情況已經完全改變了本發明,同時在很寬的范圍內發射的光源,但仍像激光器在可聚焦。


這些源采用了光纖紅外激光發射光脈沖在大約80兆赫。這種化合物被用于作為“種子”,即提供了一個精確的時鐘,但具有相當低的能量。一個二極管泵浦的激光放大器中放大,其后的脈沖。放大激光也是基于光纖的,兩個系統都無縫耦合光纖熔接。放大器的輸出可能會達到約10 W的紅外光的平均功率,但切碎約脈沖。200 PS80 MHz。這種高能量的脈沖,最后集中在一個所謂的光子晶體光纖(PCF)的入口表面的。這些纖維具有在纖維的中心的空心管的圖案的。強烈的非線性過程在單色光擴散成一種廣譜達到藍色或什至紫外線管圖案的表面,導致包括群速度色散(最多順序排列),自陡,拉曼散射和等離激元的裂變。


根據不同的PCF的長度,單色紅外峰頻譜擴散到高達幾百納米。典型的纖維長度為0.52米。


WLL-Figure-1_04


圖 1:左:光子晶體光纖橫截面??招墓艿闹行膱D案是復雜的非線性光子相互作用產生的光子能量廣泛的空間。
右:白色的激光所產生的放大紅外脈沖激光,這是美聯儲通過光子晶體光纖。PCF是一個堅實的*連續譜發生器。連續體的寬度取決于光子晶體光纖的長度-以及許多其他的工程細節。所有零件的基于光纖的固有的免維護。通過棱鏡產生的PCF的出口處的頻譜,并投射到一張紙上。


顏色和強度的兩維聲光調諧


就像在任何其他的顯微鏡,使用白色熒光照明源,白光激光共聚焦顯微鏡[需要一種手段來選擇顏色,具體地激發各種熒光染料。如果可能,多種顏色是非常有用的并行乘法染色樣品的激發。在寬視場熒光顯微鏡中,這個任務是由激發光濾光片。具有3個或4個傳輸頻帶dichroitic過濾器用于多染色樣品。


從*連續發射的光束提供一個更靈活的解決方案。的聲光可調諧濾波器可以挑選出的頻譜單行(這實際上是一個狹窄的扁帶),并轉移到一個不同的方向。頻譜的其余部分將通過晶體直行。由于顏色的扁帶是由機械激發頻率控制的偏轉,從輸入頻譜可以選擇任何顏色的無級可調。該扁帶的寬度是約1 ... 3納米的波長而定。這樣的細帶中的能量是在幾毫瓦,這是足夠遠成像的和經常使用的,即使對于FRAP實驗的范圍內。通過添加更多的電子驅動器,以產生在晶體中的機械波,它是可以直接到為了同時一系列顏色。八色同步標準(但不是技術限制)。這些bandlets中的每一個都是可調諧的波長和強度。


這種組合使白光激光共聚焦顯微鏡激發WLL的理想來源。它將為所有已知的染料在可見光范圍內激發,它允許記錄激發光譜探索新染料的光譜特性,尤其是在原位。和它給自由調整激發離峰,如果這是需要的發射收集的原因或提高分離相鄰的染料。


WLL-Figure-2_01


圖 2:采用的聲光可調諧濾波器,提取了一系列的各種顏色的bandlets的*連續譜源的白色發光??烧{諧這些bandlets是在顏色和強度。同時使用了一些bandlets需要并行乘法染色樣品的激發。


聲光分束(AOBS)可以做的工作


WLL-Figure-3


圖 3:只自由可調諧分束裝置可有效地作為依賴于波長的激發和發射閥,用于當使用一個可調諧源。聲光的分束器,可以無級調節,同時適應任何給定的一系列激發顏色。

 


激發顏色自由可調性方面非常有利的啟動一個新的挑戰:什么樣的設備可以喂飽無級調諧到入射的光的熒光顯微鏡的光路中的光?最簡單的方法是使用一個灰色的分束器,但這將是:總是失去態激發能的目標部分的犧牲 盡管這是較小的問題。這種方法的嚴重缺點是寶貴的發射光的損失。即使使用灰分離器80/20(這將浪費的激光能量的4/5)的排放量的五分之一將被犧牲掉。


一個單一的分色鏡,即使有多個頻段,顯然不可能支持一個可調光源的好處。一個單一的排放慢調諧的一種方法,已經商業化的非連續光源。該系統采用了約序列。10二向色反射鏡,將用于在其工作頻率 給只有10種,滿分為200的范圍內 而它們也可用于指定的波長的兩側。這使得一共有30種顏色,但明顯低于**的表現。


這種困境的一個**的補救辦法是使用聲光。聲光可調諧光束分離器(AOBS)是一種裝置,允許的光路與*過95%的效率,而頻譜的其余部分被引導到不同的方向,被送入一系列的顏色bandlets。在一個多扁帶的可調諧激光器的情況下,如操作AOBS使得激發的顏色傳遞順序作為激發光束路徑的進入。 


將被有效地傳遞到檢測路徑的完整的發射光譜。線程化所需的在樣品上的激發扁帶的透射光譜中的空隙的扁帶本身(因為它們所產生的相同的技術)相同的尺寸,同時可控制在它們的位置:只要一個曲調的激發顏色,適當的平行的電子調諧相應的間隙。無需任何操作者的操作是必需的。


的聲光可調諧分束器,因此最終的耦合裝置,用于可調諧多色激發。


激發和發射光譜的強度和熒光壽命


光譜檢測儀(SP)是專為帶寬和完全控制中心檢測到的發射譜帶顏色。這可以保證*的吞吐量(傳動效率高)和*分離。作為一個副作用,SP檢測器允許記錄的發射光譜,以及 5個通道)可以同時或依次(多達400個),或這兩種方法以混合模式。在過去,被綁定到安裝在系統中的激光器所發出的幾行的發光顏色。隨著白光激光器(WLL),情況已經完全改變:顏色1nm的精度可調,順利激發譜是整個可見光譜。在與SP的檢測器,它能夠適應伺服控制的激發波長的組合,這種測量是完全自動進行。它是合理可行的實施聲光分束器引導激發和發射光。


有一個可調的激發和一個可調諧發射,下一個步驟是創建一個二維的強度相關的地圖[。這拉姆達方地圖是特別有用的復雜混合物的熒光染料時,需要分開。這也是一般價值熒光染料時,需要的特點-要么是因為他們的新發現或設計,或者是因為由于微環境條件下,感興趣的頻譜改變。


特點是熒光發射強度和熒光壽命。要確切衡量壽命,脈沖光源是必需的。幸運的是,白色光的激光是一種脈沖源,脈沖頻率適合的典型的熒光壽命(0.5 ... 5納秒的范圍內)的需要。如果需要更長的脈沖間隔,脈沖選擇器降低脈沖頻率。當然,白色光可調諧激光直接呈現終身激發光譜,包括下一個合乎邏輯的后果:一個二維激發發射終身地圖。


Fig4_zusammen


圖 4:記錄,可將6個不同顏色的有孔玻璃珠。左:假色由一個激發發射λ-方掃描記錄,可在有孔玻璃珠的凸起。右:偽三維視圖的激發發光的地圖(熒光橫向)。人們可以很容易地找到六種不同的熒光染料(箭頭)的峰值。


光門 全色電子屏障過濾器


最后一件事啟用了*的技術?;旌咸綔y器(HyDs)非常敏感,快速,覆蓋一個大的動態范圍。他們提供了一個門控操作模式。在脈沖白光激光的結合,它是現在可以只在光脈沖之間的時間間隔來檢測熒光發射 只是由門混合檢測器的收集沒有在激光脈沖的信號。然后,檢測到的信號是純熒光,并且不包含任何反射光。這一做法,剩余反射的顏色對抗輕松拿下。有沒有必要限制排放留出了足夠的空間,以激發顏色集合。它甚至有可能激發下方直接測量 和*越,然后允許反斯托克斯發射特性。


脈沖和光譜可調白光激光光源,結合聲光可調分束器,可調SP探測器和門控混合探測器是一個巧妙結合*的技術。而且,雖然這句話聽起來可能有點穿,它適合在這里:它***的概念和操作共聚焦顯微鏡。


Fig_5_02


圖 5:通過門控檢測,也能夠非常有效地,純粹只記錄從樣品中的熒光?;旌咸綔y器(HyDs)作為**的傳感器在這方面。在收集數據期間被分配的激發脈沖,并因此只有發射的熒光收集。左圖:錄制的綠色熒光激發后,在492 nm處。排放收集490-600納米。主信號的反射光作為激發波長為的集發射頻帶內。右圖:相同的激發波長和發射集合帶,但光門。沒有反射光被記錄下來。純的和明確的熒光發射,,不管發射帶。





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